TCR 载体构建体设计 TCRshows

把一条 TCR 的蛋白 ORF 变成能直接送去合成、克隆进你自己载体的 DNA 插入片段。 从 序列工具拼出来的 α / β 两条可变区开始：接恒定区、2A 连成单一 ORF、选克隆位点， 再按载体语境做密码子优化。 密码子优化按载体语境取舍：慢病毒与 γ-逆转录病毒的基因组 RNA 不能被剪接、不能提前加尾， 所以隐蔽剪接位点与 poly(A) 信号是硬约束，这与 mRNA 药物的优化目标并不相同。 计算在你的浏览器本地完成，序列不上传。

1TCR 链序列

分别粘贴 α 链与 β 链的可变区序列，氨基酸或 DNA 均可——例如 序列工具由 V + CDR3 + J 拼出来的那两条（含前导肽即可，不含恒定区）。

2恒定区与链间连接

两条链接上恒定区后，用一个 2A 自剪切肽连成单一 ORF。 恒定区的第一个残基——它由 J 区余下的那 1 个碱基与恒定区头两个碱基合成一个密码子， 所以 α 链必须指明 TRAJ（有 N / D / Y / H 四种可能），而 β 链恒为 E（16 条 TRBJ 的尾碱基全是 G）。

3克隆位点

选定的酶会自动进入「必须规避」清单，优化器保证它们在插入片段内部不出现——这样两端加上位点后才是唯一切点。 优化完成后下方还会按实际序列列出全部可用的酶。

酶切位点太靠近片段末端时切不动，两端各留一段间隔；间隔序列会逐个候选试过，选一个不会在接缝处凭空造出危险基序的。

4载体与元件

这些选择决定了哪些序列特征算「危险」，以及包装容量还剩多少。

5密码子优化与规避

优化目标是「在保持氨基酸序列逐字不变的前提下，把硬约束清零、把 CAI 尽量抬高」。硬约束的权重远大于 CAI，所以它们近似不可违反。

必须规避的序列特征

额外需要规避的酶切位点

第 3 步选定的两个克隆酶已自动纳入，无需在此重复勾选。这里勾的是下游还想保留的其它切点。

i方法、依据与局限

各项检查的判据

必须知道的边界。 ① 剪接位点是基序匹配，不是剪接预测器——本页匹配的是公认的共有序列核心， 会有假阳性（很多匹配并不会被真正使用），也会漏掉靠剪接增强子起作用的位点。 它的用途是「在合成之前把明显的雷排掉」，不能替代实测。
② 本页不提供启动子、WPRE、LTR 的实际序列。这些元件动辄几百到上千碱基， 抄错一个碱基就是一个静默失效的构建体，所以只按你选定的元件核算长度与容量、给出适用性提示， 实际序列请以你所用载体图谱为准。本页输出的是插入片段本身（克隆位点 + Kozak + ORF + 终止密码子）。
③ 包装容量是估算。骨架固定开销按常见慢病毒/γ-逆转录载体的典型值计， 不同载体差异可达数百碱基；接近上限时滴度会明显下降，请以实测为准。
④ 密码子优化只保证翻译产物逐字不变，不保证表达一定更高——CAI 与表达量的关系是统计性的。